動物試驗的替代方案？仿生晶片應用於藥物開發｜許藝瓊副教授 國立中央大學生醫科學與工程學系

動物實驗是目前新藥開發必經的臨床前驗證過程，是推進人類醫學與生命科學發展的必要之惡。根據近期研究預估，每年約有 1 億隻脊椎動物在世界各地進行實驗，而僅歐盟每年就有約 1.1 千萬隻脊椎動物被用於醫藥實驗。其中，以用於基礎研究的動物數量最多，其次是生物醫學研究、以及針對家庭產品和其他消費品所進行的毒性測試等。於此同時，有許多營利性的公司每年飼養與銷售幾千萬隻的實驗動物，藉以獲取龐大利潤。

面對動物實驗的殘忍議題，一直以來持續引發激烈論戰，所有人不得不承認，科學上越適合當作實驗對象的動物，往往讓實驗在道德面站不住腳。所幸，隨著生物科技的進步，某些特定動物實驗已找到了替代方案，也有許多藥物的安全性已被確認，再加上動保觀念的提升，促使各國近年來紛紛修法減少動物實驗。而全世界對於對待實驗動物，也已有奉行「3R原則」的普遍共識。所謂的 3R 原則指的是替代（Replacement）、減量（Reduction）、與精緻化（Refinement）。然而，欲避免有任何動物再為實驗犧牲，全面開發替代方案才是根本的解決之道。

閎康科技於本期特別邀請了國內在 3D 動態培養及基因體學分析領域的頂尖學者 許藝瓊教授，為「科技新航道 | 合作專欄」撰文介紹仿生晶片相關技術及其應用發展概況，與讀者分享此一新興生物科技領域的學術研究進展。

閎康科技研發中心處長 陳弘仁 2022/9/15

動物試驗的替代方案？仿生晶片應用於藥物開發

許藝瓊 副教授

中央大學 生醫科學與工程學系

 （本篇由許藝瓊副教授撰寫、閎康科技修編）

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傳統 2D 靜態細胞培養技術是一種平面的培養方式，由於其和體內實際的立體生長環境差別很大，此極易導致細胞的成長結果在形態、分化、細胞與基質間的相互作用、及細胞與細胞間之作用等諸多方面，與真實的體內細胞行為有明顯差異。因此，為了進一步確認該細胞培養結果的正確性，通常還是會需要再進行相關的動物實驗來求證。然而，建立動物模型的代價極高[1]，需要花費漫長時間、昂貴成本，且必須克服潛在的小鼠基因組污染等問題，此也大大限制了 2D 靜態細胞培養作法的可能應用空間。有鑑於此，為了加速生醫領域的研究發展，近幾年學者們紛紛開始尋求更具潛力的替代方案。

傳統的平面靜態細胞培養方式，大多是使用聚苯乙烯為材料的培養皿來進行。這種作法雖然可以大量地培養出細胞，但難以模擬細胞處於體內生理環境時的真實生長行為。大多數細胞需要來自 3D 環境的線索，才能培養出接近體內的相關生理組織和器官。舉例來說，膠原蛋白和基質膠是用來包覆培養細胞的常見材料，而以往在 2D 或準 3D 環境中進行的基質硬度對細胞行為與功能影響之相關研究，皆已獲證實，其結果無法代表體內的真實狀況。近年來，隨著生物科技的不斷演進，帶動了細胞培養技術發展逐漸從 2D 走向 3D，而其中以應用仿生細胞晶片作為藥物開發工具的相關研究，最受到廣泛關注。

仿生細胞晶片主要是透過 3D 的動態培養方式，來模擬接近體內條件的組織細胞作用情形。以 3D 方式培養的細胞，可在各個面向真正實現細胞與細胞間接觸，並可透過不同的細胞類型和細胞外基質應用，設計出複雜的組織結構，使其與體內細胞行為及基因表達趨勢相符合，藉以模擬體內例如氧氣和營養輸送的梯度變化等現象。透過 3D 細胞培養作法的輔助，能使藥物篩檢的數據更加正確，也能更精準地預測藥物濃度所帶來的效益及毒性，其具有無限的未來發展潛力[2]。

利用仿生細胞晶片來建立仿生培養模型，目前已是生物科技領域的熱門研究方向之一，尤其是近幾年相當熱門的研究主題「器官晶片（Organ-on-a-chip, OOC）」，更得以最大程度地模擬體內環境，為醫學及藥物研發帶來全新的可能。仿生細胞晶片的應用，不僅可作為藥物篩檢平台，在模擬環境下正確篩檢出有用的候選藥物，同時也能夠作為藥物治療評估及藥效作用機轉確認之測試平台，經由基因定序分析及功能性探討藥物影響下的標的訊息傳遞途徑，來建立各種生物標記。

所謂「器官晶片」是指在微系統晶片（Microsystem）上，模擬人體內器官運作的情形，此概念最早由美國哈佛大學的 Donald E. Ingber 和 Dan Dongeun Huh 提出[3,4]，他們起初是在一微晶片上成功模擬肺器官之運作（圖 1）。該晶片構造主要藉由一聚二甲基矽氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）薄膜，將中央區域的微流道分為上下兩層。PDMS 是一種高生物相容性、且高彈性的材料，很適合在上面培養細胞。該 PDMS 薄膜表面上開有許多小孔洞，而上下兩端的流道內分別通予空氣和血液，用來模擬氣管和血管。其左右側的流道則是提供適當真空，用以給予該薄膜張力。當施與 PDMS 薄膜高張力時，可模擬肺泡膜的漲縮動作。

圖1　仿生肺晶片裝置。

圖 1 （A, B）說明該微流體晶片如何模仿肺部環境，其通過對兩側室施加真空引起機械呼吸，來造成類似生理呼吸作用的 PDMS 薄膜拉伸。（C）是將晶片的上下部份與 PDMS 薄膜層粘合在一起。粘合之後如（D）所示，再使用適當蝕刻劑對兩側通道內的 PDMS 膜層進行選擇性蝕刻移除。（E）是完成製作的實際肺微流體晶片外觀[3]，透過此仿生晶片，可真實模擬緊密貼合的人類肺上皮和內皮細胞層組成結構，並經由通入空氣和流體流動、及週期性的薄膜機械應變，來模仿肺部組織的正常呼吸運動。目前基於傳統 2D 細胞培養模型的臨床前藥物開發研究，仍需依賴於昂貴且耗時的動物實驗測試。藉由此晶片的通道與薄膜設計來創建模仿人類肺部疾病的測試模型，將有機會省去後續動物模型的驗證需求，快速方便地達到肺泡-毛細血管界面作用的研究目的。

目前類似原理的微型仿生細胞培養晶片，已被成功應用在模擬不同的人體器官功能，例如上皮層和內皮層間之多層界面經歷呼吸誘導的循環機械拉伸[5]等相關研究。而對於常用的體外研究模型，例如體外靜態癌細胞培養，仿生晶片技術無論在實驗操作、所需時間、及高通量篩選（High Throughput Screening）等方面，均具有相當大的應用優勢。事實上，近年來經由仿生晶片的研究，已成功篩選出離子通道抑製劑（GSK2193874），用以治療 IL-2 對肺部造成的毒性[6]。期望生醫領域盡快開發出更多整合功能的器官晶片，能夠大幅取代早期活體動物測試，快速便利地觀察細胞或組織的生理改變。同時，也期待研究者未來還能進一步在晶片的細胞內製造相當程度的疾病產生，用以觀察疾病是否因為藥物投入而得到緩解。

在疾病形成機制的應用研究方面，仿生晶片已可使用生物工程方法來控制拉力與流力，並準確評估細胞變化和臨床治療的結果[7]。圖 2 整理了目前可模擬肺癌轉移不同階段的各種相關微流控設備[8]，例如利用通入水凝膠的微流體晶片裝置，經混合膠原的基質膠組合物，來模擬肺細胞於不同的癌症侵襲階段的微環境。其作法是經由形態改變和機械力作用來調整水凝膠晶片狀態條件，再使用定量圖像分析測量 H1299 肺腺癌的癌症細胞在不同的實驗條件下之遷移結果。

圖2　用於研究肺癌轉移的各種仿生微流體晶片設計[8]。

由此類仿生晶片研究結果發現，肺腫瘤細胞可從膠原基質中的間充質遷移到接近膠原基質膜，此將可應用於高通量藥物篩選研究和治療藥物評估[9]。此外，此類晶片也具模擬生理參數的能力，可為動物實驗提供另一種潛在的替代方案，用以預測抗癌藥物的功效及毒性（圖 3 ）[10]。

圖3　化學療法（包括 Cisplatin 和 Etoposide）的藥物敏感性。 (a)：顯示在第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）Cisplatin 處理後，在微流體晶片裝置上培養 LCO 的形態變化圖像。 (b)：在 Etoposide 治療後第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）在微流體晶片裝置上培養的肺癌細胞圖像。 (c)：第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）經 Cisplatin 處理後，在塑料粘附的基底膠（Matrigel）小滴中培養肺癌細胞的形態變化圖像。 (d)：第 1 天（T-24 h）和第 3 天（T-72 h）依 Etoposide 處理後，在粘附有塑料的 Matrigel 液滴中培養 LCO 的代表性圖像。 (e)：使用微流體晶片裝置在藥物處理 72 小時後通過螢光測量細胞活力。 (f)：在藥物治療後 72 小時通過螢光測量細胞活力[10]。

在病毒流行期間，抗病毒藥物的快速篩選是非常緊迫的需求。仿生支氣管晶片可用以模擬病毒感染、菌株依賴性毒力、細胞因子產生和循環免疫細胞活化的情況等，其在抗病毒藥物效果評估與劑量測試的應用上便利性極高，可加速篩選具有潛力的治療藥物（圖 4 ）[11-13]。

圖4　肺仿生晶片模型上的病毒感染圖示。 (A)：用於研究流感抗藥性發展。 (B)：體內 3D 人肺泡-毛細血管屏障、感染 SARS-CoV-2 的仿生肺泡晶片。 (C)：通過結合上肺泡上皮通道和下微血管內皮通道的多孔膜而設計的人肺泡晶片。 (D)：用於人類宿主-病原體相互作用研究的多組織呼吸道芯片模型，包括鼻、支氣管和腺泡氣道。 (E)：人類肺晶片模型中的 SARS- CoV-2 感染結果[12]。

與動物模型相比，器官晶片（Organ-on-a-Chip）可以更加正確地模擬人體系統，藉由控制各種不同的參數，來精確定位藥物靶點，例如癌細胞遷移和侵襲、細胞外訊號傳導、腫瘤微環境中的生物物理因素和腫瘤異質性[14-16]等。臨床前藥物開發的主要階段為臨床前發現早期潛力藥物和活性測試，而仿生晶片技術如何在藥物開發的不同臨床階段發揮其關鍵應用效果，也是未來極重要的研究方向（圖 5 ）。

圖5　應用於臨床前藥物開發階段的仿生晶片平台[17]。 (a)：具有仿生血管網絡（右）（HUVEC，紅色）和胰腺癌導管（PD7591 細胞，綠色）的 PDAC-on-a-Chip（左）。 (b)：具有仿生腫瘤-免疫-血管相互作用的生物工程膠質母細胞瘤腦腫瘤模型表明，腫瘤相關巨噬細胞對免疫抑制的阻斷改善了抗 PD-1 免疫治療。 (c)：非小細胞肺癌微環境模型研究發現，肺呼吸過程中的機械力（兩側通道的真空驅動）可能會增加 NSCLC 細胞的抗藥性。 (d)：應用多器官系統晶片，預測尼古丁的藥物動力學參數。 (e)：肝器官晶片用於分析由藥物-藥物相互作用引起的藥物不良反應。 (f)：多重生物標誌物分析模塊集成的多器官平台，用於監測肝臟毒性及器官間代謝介導的心臟毒性。 *縮寫：NSCLC-非小細胞肺癌、PDAC-胰腺導管腺癌。

不同的組織具有不同的機械性質，例如柔軟的組織如大腦（~1 kPa）、具有韌性的組織如骨骼肌（~10 kPa），以及能夠負荷高強度的骨組織[18,19]等。根據研究資料指出，這些構成體內微環境的組織，其力學性質包括細胞外基質的剛性（Stiffness）、幾何結構等，也會對細胞的生理作用有所影響。而這些微環境的剛性程度多半取決於特定細胞外基質的組成[20]，並會直接影響許多體內重要生理機制的運作，包括幹細胞的分化、傷口癒合、及形態發生（Morphogenesis）過程中的細胞遷移[21]等。

因此，若透過改變基質的硬度，來調整對細胞所施加的力，或直接對細胞施以外源性力刺激，將可以控制幹細胞分化的走向，藉此實現控制幹細胞的細胞系譜（Cell Lineage）分佈和形成之目的。此方面的細胞調控技術十分重要，但若是採用傳統細胞力學研究方法，只能侷限在 2D 的狀況下對細胞進行機械力刺激、來了解相關生理機制，其所獲得之結果與實際生物體內狀況能否一致，仍然有很大的疑慮。因此，對於可提供 3D 環境、適合體內細胞生長的仿生晶片應用，預期將在此類的研究中扮演關鍵角色。

本文作者 許藝瓊教授及其實驗室研究團隊，長期致力於動態仿生晶片之應用研究，迄今已發表過許多重要的研究成果。當前對於細胞的效應研究和毒性測試，製藥工業最常採用的依舊是 2D 方式，不過 3D 培養技術已在學術研究中被廣泛應用。隨著生物技術的演進、伴隨 3D 培養成本降低，3D 培養在再生醫學、基礎研究和藥物研發中的應用已越來越廣泛且重要，並且也讓細胞培養技術由 2D 培養走向 3D 培養、再到3D動態培養（3D Dynamic Culture）的組織工程、並整合系統生物學的大數據分析。採用動態培養不同於以往靜態效果，既能最大程度地模擬體內環境，又能展現細胞培養的直觀性、條件可控性之優勢，對於生物科技的創新研究有著非常重要的意義（圖 6 ）。

圖6　人工智慧動態培養基因資料庫、次世代動態培養技術整合於藥篩及再生醫學之應用。

再者，建置仿生器官晶片基因表現資料庫，將可作為癌細胞轉移評估與藥物篩檢平台，能篩檢出適合的藥物治療標的，並透過基因體學分析及功能性，探討藥物對腫瘤細胞生長、侵襲性、抗藥性的標的訊息傳遞途徑及其對正常細胞之毒性指標，以建立相關之多種生物標記，應用於生物風險評估與藥物開發，此對於生物科技的未來發展也將具有龐大的市場潛力。

最後，值得注意的是，近年來藉由 3D 培養衍生出許多不同的細胞技術，例如類器官的製備[22]，但由於類器官不能生長到毫米以上，而使它們缺乏天然器官的結構特徵，因此無法展現更高級別的功能特徵，此為現有技術發展之瓶頸與挑戰[23]；而在藥物開發上，許多在動物實驗上有效的藥物，應用在人體卻是無效的[24-26]。目前的臨床前研究方法，在預測結果方面其實成功率還是非常有限。因此，持續藉由開發新的仿生培養模型，來提高藥物治療評估的預測有效性，也將是生醫科技發展的必然方向[27,28]。

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根據市場研究顯示，到 2020 年為止全球用藥量約有 4.5 萬億的單位劑量，並有超過 200 種以上的新藥上市。每個新藥上市通常需經過四大階段，而其於人體臨床實驗之前，也必須經過為期 2 年的臨床前動物實驗，來證明該藥效與安全性。然而，即使通過了動物實驗，人體臨床實驗階段還是會有將近 90% 的新藥開發，因無法預期的毒性或副作用產生而宣告失敗。而無論進行動物或人體實驗，都需要耗費龐大的經費與漫長時間、並存在道德上的爭議。因此，積極尋求動物實驗及人體試藥之替代方案，早已成為全世界生醫研究領域的共同努力目標。

仿生晶片是目前最受到業界的矚目與期待，最有機會能全面替代現有細胞與動物實驗模型，成為終極解決方案的新興科技。在 2010 年時，哈佛大學 Ingber 實驗室發表了首篇關於肺器官晶片的研究成果，此為仿生晶片的發展揭開了序幕。2011 年 9 月，美國總統歐巴馬宣布成立一項由 NIH、FDA 和 DARPA 三大機構共同主持、經費高達 1.4 億美金的仿生晶片研究計畫「微生理系統研究（Microphysiological system, MPS  system）」，以確保美國未來 20 年在新藥開發領域的全球領先地位。而 2018 年時，MIT 研究團隊也成功開發出可模擬高達 10 種人體器官組織同時運作狀況的仿生晶片，並於《Science Advances》期刊上發表此深具指標性的研究成果。數十年來，隨著各國政府及研究機構的努力，目前全球已有許多實驗室研發出包括腦部、心臟、肝臟、肺臟、肌肉、皮膚、腸道、骨骼、甚至胎盤等多種器官仿生晶片。並且，透過結合不同器官組織所建立之高複雜性微系統晶片也陸續問世，甚至成為了商品。此類整合多種器官的系統晶片，泛稱為人體晶片（Body-on-a-chip）。

人體晶片除了可替代目前部份的動物實驗、大幅降低新藥開發的成本及時間外，也可以依據個人的疾病細胞來打造專屬之疾病模型，達到更低的用藥風險及更精準的治療效果，藉以大幅增加患者治癒機率與降低死亡率。在藥物傳輸的途徑中，大部份的藥物都不是直接作用治療到患部，而是必須經過其它的傳輸途徑，例如口服藥物，多半必須經過腸道吸收及肝臟代謝之後，才會產生治療活性；而藥物在人體傳輸過程中，可能對患部外的其它器官產生毒性、或造成傷害。藉由人體晶片的應用，可先在體外模擬人體不同組織器官的功能特徵、及所有器官之間的相互作用生理效應，用以預測人體對藥物或外界不同刺激所產生的反應。未來此種結合多種器官的仿生晶片，也可能作為測試藥物動力學的模型，用以了解藥物在人體內如何吸收、分布、代謝、消除、及其所造成的毒性影響等。

本文作者　許藝瓊教授目前任職於中央大學生醫系，其同時為該校「癌症基因體實驗室」的主持人。許老師長期致力於腫瘤基因體學、以及醫學系統資料庫分析之相關應用研究，目前已發表的期刊論文超過 60 篇，並擁有數篇重要發明專利，其深具學術創新的研究成果，也分別於 2019 及 2021 年榮獲台灣創新技術博覽會金牌獎與銅牌獎。閎康科技非常榮幸今年度可以和許教授攜手進行產學合作，提供該實驗室團隊在建構癌症藥物治療的仿生組織研究方面所需之完整分析服務。閎康科技擁有完備的生醫及液態奈米樣品檢測技術，能全面滿足奈米醫藥相關研究之各種分析需求。