K-kit——ナノ流体の原位電子顕微鏡分析に応用される革新的なマイクロチップ

 

K-kit ナノ流体のインシチュ電子顕微鏡用の革新的マイクロチップ

 

 

陳弘仁

Hung-Jen Chen

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ナノ液体の応用が拡大する中、世界的に液体ナノ製品の検査基準がますます厳格になり、溶液中のナノ粒子の形態と分布を正確に分析することが求められています。近年、透過型電子顕微鏡（transmission electron microscope, TEM）は液体の原位分析において進展を遂げており、特に微型液池シリコンチップ技術が注目されています。本稿では、革新的な微型液池チップ「K-kit」を紹介します。このチップは毛細管力を利用して迅速に溶液をロードでき、さまざまなTEM装置に適合し、湿式負染色を通じてナノ粒子の画像コントラストを向上させることができます。K-kitは多くの独自の製品優位性を持ち、学術研究や電子、化学、医薬、食品などの産業分野でのナノ液体分析に広く応用されています。

 

ナノ流体の応用が拡大する中、液相ナノ製品の分析に関する国際基準はますます厳格になっており、溶液中のナノ粒子の形態と分布の正確な特性評価が求められています。近年、透過型電子顕微鏡（TEM）は、特にマイクロ流体シリコンチップ技術の開発により、インシチュー液体分析において大きな進展を遂げました。この記事では、毛細管力を利用して溶液を迅速にロードし、さまざまなブランドのTEM機器と互換性があり、湿式負染色によってナノ粒子の画像コントラストを強化する革新的なマイクロ流体チップ「K-kit」を紹介します。K-kitは、いくつかの独自の利点を提供し、学術研究や電子工学、化学工学、製薬、食品などの産業で広く応用されています。

 

 

ナノ液体の分析ニーズと課題

ナノ液体の応用は日常生活に深く浸透しており、ナノテクノロジーの発展に伴い、欧米各国は最近、液体ナノ製品の表示と審査に関する規制を推進しており、最終製品の物理化学的特性について包括的な分析が必要であることを強調しています。特に液体環境下では、ナノ新物質の成分の種類、サイズ形状、粒子濃度、粒径分布、及び凝集などの重要な特性を評価し、製品の安全性と安定性を確保する必要があります。

 

国際標準化機構ISOは2012年5月にISO/TR 13014:2012《ナノ技術－毒理評価に必要な人工ナノ材料の物理化学特性分析ガイドライン》(Nanotechnologies - Guidance on Physico-chemical Characterization of Engineered Nanoscale Materials for Toxicologic Assessment)を発表し、毒理学評価を行う前に物理化学特性分析を完了する必要があることを強調しました。これにより、ナノ材料とテスト結果との関連性を確立します。図1に示すように、この基準はナノ検出の8つの重要なパラメータを列挙しています。これらのパラメータは、ナノ材料の安全性、環境影響、および製品応用を評価する上で重要です。さらに、ISO/TR 13014:2012は、研究機関や企業が一貫したナノ材料評価プロセスを確立するための標準化されたテスト方法を提供しています。

 

図1. ISO/TR13014 規範 8 項重要ナノ検出パラメータ (2012 年版)

 

 

ナノ材料の分析方法は表1に示されているように、多くのプロジェクトは市販の機器を通じて検査を行うことができるが、ナノ溶液分析技術は依然として多くの課題に直面している。特に「形状」、「粒径／粒径分布」、「凝集／集団化」、および「溶解度／分散性」の4つの検査パラメータについては、溶液中の粒子の実際の画像情報を取得する必要があり、分析結果の正確性を確保することができる。ナノ産業の検査ニーズを満たすために、電子顕微鏡を使用して微視的なスケールで溶液内のナノ粒子を直接観察できれば、製品の成分と特性に関する最も真実な画像情報を得るのに役立つ。

 

表1. 一般的なナノ材料分析方法

 

透過型電子顕微鏡は長い間、材料構造を探求するための重要な技術であり続けてきました。近数十年にわたり、この技術は多くの画期的な発展を遂げてきました。例えば、像差補正技術は原子レベルのスケールでのイメージングを実現し、冷凍電子顕微鏡技術は生物試料に高解像度の画像観察を提供し、さまざまな革新的なTEM構造設計により、動的システムの原位分析が可能になりました。近年、シリコンチップを基にした原位技術が急速に発展し、真実の環境条件下での材料や生物試料の動的変化を観察する実験が、TEMの高真空環境内で行えるようになりました。その中で、最も注目されている技術の1つは、シリコンチップを用いて液体を封入し、TEM内でナノスケールの液相ダイナミクス観察を実現することです。⁽¹⁾。液体原位TEM（in-situ liquid TEM）を通じて液相反応のイメージング観察を行うことで、研究者は電気化学プロセス、抗菌および病理メカニズム、生物細胞の挙動などの重要な分野の基礎原理を深く探求することができる。

 

 

二、液体原位電子顕微鏡技術の進化

その場電子顕微鏡 (in-situ electron microscopy) 技術の発展は、従来の電子顕微鏡が高真空環境でのみ実行できるという制限を突破しました。1950年代から1960年代にかけて、学者たちは制御されたガス環境下での電子顕微鏡観察を探求し、これらのガス環境技術が電子ビームによる試料の損傷を効果的に減少させることを発見しました。その中で Heide (1962)⁽²⁾関連する研究は、後の液体環境下での電子顕微鏡観察の重要な基盤を築きました。しかし、このように装置の構造を直接変更し、流体の配管をTEMの真空室内に設置する方法は、コストが高く、清掃やメンテナンスが困難であり、溶液漏れのリスクも存在します。また、従来の機械加工精度の制限により、高解像度のナノ粒子画像を得ることも難しいです（液層が厚いため）。

 

1990年代に、液体セル（liquid cell, LC）技術が登場しました。この技術は、強靭な薄膜材料（シリコン窒化物 SiN など）を使用して溶液サンプルを封入し、電子顕微鏡で液体状態を維持しつつ、電子ビームの透過に影響を与えないようにしています。精密加工技術の進歩に伴い、動的観察を実現し、より強力な液体フローピット（liquid flow cell, LFC）へと徐々に発展しました。この技術の核心は、特別に設計されたTEMサンプルホルダー（TEM holder）を利用することで、その内部に流路システムが統合されています。そのサンプルホルダーの先端では、精密にロックされた2枚のシリコンウエハー、金属カバー、シールリングなどの要素を通じて、液体の流動能力を持つ液池観察ウィンドウが形成され、研究者はナノスケールの液体サンプルの動的変化を観察することができます。現在、オークリッジ国立研究所（Oak Ridge National Laboratory, ORNL）とアメリカ国立電子顕微鏡研究所（National Center for Electron Microscopy, NCEM）は、この研究分野で先駆的な地位を占めており、Hummingbird Scientificなどの多くのTEM原位サンプルホルダー（in-situ TEM holder）商業設計会社を積極的に支援しています。⁽¹⁷⁾和 Protochips⁽¹⁸⁾、実際の製品の開発と販売を推進しています。また、オランダのDENSsolutionsやスウェーデンのNanofactoryなどの企業も市場に参入し、この分野の重要な競争相手となっています。

 

半導体プロセスと精密加工技術の進歩により、現在の液体原位TEMサンプルホルダー（in-situ liquid TEM holder）製品は、液体の流動、加熱、通電などの機能をサポートすることができ、研究者は電子顕微鏡内で液体環境を操作し、連続反応観測を実現することができ、ナノ材料の成長、触媒反応、電気化学反応などの研究を推進しています。図2はProtochips社が提供する液体原位TEMサンプルホルダー製品とその付属品です。しかし、このような原位観測技術は通常、特定のメーカーが提供するサンプルホルダーに依存し、専用設計のシリコンチップを使用する必要があるため、装置の互換性が制限され、コストが高くなります。また、サンプルホルダーの組み立て、漏れテスト、前処理、清掃などのプロセスも非常に煩雑で、単回の観測には数時間以上かかることが多いです。したがって、現在の液体原位TEMサンプルホルダー製品の応用は、主に学術研究分野に集中しており、産業界の高効率、低コスト、大量分析サンプルの検出ニーズを満たすことが難しいです。

 

図2.アメリカのProtochips社の液体原位TEMサンプルロッド製品 (画像出典：⁽¹⁸⁾)

 

2016年、国内有数の半導体検査大手MA-tek (Materials Analysis Technology Inc.) は独自の特許技術に基づき、一体型マイクロ液体セルチップ「K-kit」を開発し、ナノ溶液試料のTEM画像解析に革新的なブレークスルーをもたらしました⁽¹⁶⁾図3に示すように、K-kitは一般的なサイズの3 mm外径のTEM標準銅環を支持プラットフォームとして採用しており、高い互換性を持ち、Hitachi、FEI、JEOLなどの主要ブランドの電子顕微鏡装置に直接適用でき、高価な液体原位TEMサンプルロッドを追加購入する必要がありません。さらに、その一体型構造設計により、サンプル準備プロセスが大幅に簡素化され、操作がより迅速かつ便利になり、検査コストも削減されます。図4は、K-kitによる異なるナノ溶液の電子顕微鏡画像観測結果を示しています。その高い適用性、便利さ、経済性により、K-kitは学術研究の分析ニーズを満たすだけでなく、産業界にも実用的な液体ナノ材料検査ソリューションを提供します。

 

図3.K-kitはTEM標準の銅環を使用しており、さまざまなブランドのTEM装置で観測することができます。

 

図4.K-kitによる各種ナノ溶液サンプルの電子顕微鏡画像観測結果

 

 

三、ナノ液体分析の新しい武器K-kit

3.1 K-kitの構造原理

K-kitチップは、微小電気機械システム（MEMS）技術を用いて製造されており、その構造は二枚の対称設計のシリコンチップを上下に整列させ、高温接合や湿式エッチングなどのプロセスを経て形成されています。図5は、製造が完了したK-kitウエハの外観と単一のK-kitチップの走査型電子顕微鏡（SEM）画像です。図6に示すように、K-kit内部の中央には微小な液体貯蔵通路が設けられており、その通路の両端の開口部を通じて溶液を充填し、密封することができます。K-kit本体構造の上下両面にはそれぞれ凹槽が設定されており、その凹槽の底部にはナノ厚の窒化シリコン（Si）からなる層があります。₃N₄薄膜で構成された液池観測窓は、電子顕微鏡の電子ビームが透過し、画像を形成することを可能にします。K-kitの構造本体は硬いシリコン材料で作られており、窒化シリコン薄膜も高い強靭性を持っています。これにより、K-kitチップは極めて大きな真空環境の圧力変化に耐えることができ、加熱または冷却機能を備えたTEMサンプルロッドと組み合わせて、液体サンプルを変温条件下で原位観測することができます（推奨操作温度範囲は–196 °Cから120 °Cです）。

 

  図5.K-kitウエハおよび単一K-kitチップの構造外観

図6.K-kitチップの構造 (画像出典：(16))

  

K-kitは市場で数年販売されている液体原位電子顕微鏡画像分析製品であり、世界中の20以上の有名な電子顕微鏡消耗品販売業者を通じて購入して使用することができます。図7に示すように、K-kitの粒子サイズは1.7mm×1.4mm×0.8mmであり、上下表面の凹槽内の観測窓のサイズは300μm×25μmです。本体構造の左右両端の微細チャンネル開口サイズは、搭載可能なナノ粒子のサイズを決定します。したがって、異なるサンプルの観測ニーズを満たすために、K-kit製品はそれぞれ0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μmおよび5μmの6種類のチャンネル高さオプションを提供しています。さらに、観測窓の窒化シリコン薄膜の厚さも30nmと100nmの2種類の選択肢があります。

 

図7.K-kitチップのサイズ

 

 

図8に示すように、K-kitチップのサンプル準備操作を便利にするために、MA-tekは専用のK-kitツールボックスを設計し、ユーザーのサンプル準備の速度と信頼性を向上させています。現在、K-kitの出荷パッケージには、4個入りと6個入りの2種類があります。また、各K-kitは出荷時に1つのキャリアが付属し、透明なプラスチックカバーで密封保護されています。そして、そのキャリアの底部にはTEM標準の銅リングがあらかじめ設置されており、底板を取り外すことで使用できます。

 

図8.K-kit ツールボックスと出荷パッケージ

 

 

3.2 サンプル調製プロセス

K-kitのサンプル準備方法は非常に簡単で、図9に示されています。通常、全く新しいK-kitの両端にはそれぞれ密封ブロックがあり、微小チャンネル内の真空状態を維持し、内表面を高度に清浄に保つことで、溶液の充填効果を向上させます。使用時には、まずピンセットまたはチャンネルオープナーを使用して密封ブロックを取り外し、次に微小チャンネルのいずれかの端の開口部を液滴の表面に軽く触れさせ、ナノ溶液が毛細管力によって微小チャンネル内に吸引されるようにします。溶液が充填された後、両端に接着剤を塗布し、銅環を貼り付けます。接着剤が固化した後（簡易真空装置に置いて乾燥を促進することをお勧めします）、K-kitサンプルをTEMサンプルホルダーに装填して観察を行います。サンプル準備全体のプロセスは約30分で完了します。

 

図9.K-kitのサンプル調製ステップ

 

K-kitチップのモノリシック構造設計は、原位液体TEMサンプルロッドに対して独自の利点を示しています。一体成型の設計により、K-kitは溶液の充填量に自動的に適応し、サンプル液滴のサイズを特別に制御する必要がありません。また、K-kit内部の非常に小さな貯液チャンネルは強力な毛細管力を生み出し、高粘度または油性のサンプルでも通常は直接充填でき、追加の希釈は必要ありません（実測では、粘度係数が3,000 mPa·sを超える溶液でもスムーズに充填できます）。この設計は、溶液の充填の安定性と信頼性を確保し、操作の便利さを大幅に向上させます。

 

微細管の開口部の密封については、著名なブランドのTorr-seal真空接着剤を使用することをお勧めします。Torr-Sealはエポキシ樹脂型の真空密封接着剤で、優れた密封性能を持ち、硬化後に揮発性物質を放出しないため、高真空環境での使用に適しています。また、この接着剤は安定性が高く、ほとんどの化学溶液と反応しないため、密封時にK-kit内のサンプル溶液と接触しても汚染が発生しにくく、実験観察結果の信頼性を確保します。

 

K-kit本体構造は耐酸アルカリ性のシリコン材料で作られており、ほとんどの化学溶液に対して高い安定性を持つTorr Sealシーラントと組み合わせているため、さまざまな一般的な化学溶液の観察と分析に広く応用できる。表2は、Torr Sealシーラントをさまざまな化学溶液に24時間浸漬した後に行ったFTIR検査分析（成分が溶解しているかどうかの判断）および目視観察結果（シーラントが溶液中で拡散しているかどうかの評価）である。長時間の浸漬テスト後、ほとんどの溶液中でTorr Sealシーラントの溶解または拡散現象は発見されなかった。ごく少数の溶液のFTIR検査結果は、シーラント成分が微量溶出していることを示している。しかし、それにもかかわらず、Torr Sealはこれらの特定の溶液に対して良好な耐性を示し、短時間（約数時間）でK-kitのシーリング操作に使用でき、画像観察を無事に完了することができた。

 

表2.Torr Seal の材料が各種化学溶液に浸漬されたテスト結果(16)

 

実際の応用において、サンプル溶液がTorr Sealと化学反応を起こさない限り、K-kitを使用して画像観測を行うことができます。実測経験に基づくと、未希釈の強酸（pH約1の硫酸）や強アルカリ（pH約12のアンモニア水）などの溶液も、K-kitに安定して封入して観察することができます。しかし、強酸や強アルカリを含むサンプルの準備過程では、操作リスクに特に注意を払い、適切な個人保護具を着用して、使用者の安全を確保する必要があります。

 

さらに、K-kitサンプルの準備効率を向上させ、銅環とチップの接着不良による掴み取りの際の脱落を避けるために、MA-tekは特許技術を用いて便利なK-kit開閉式銅網（K-kit folding grid）を開発しました（図10参照）。この銅網はMEMS技術で製造されており、折りたたみ式のデザインを採用しており、上下の二つの構造を正確に合わせることができます。各半分の中央には溝が設けられており、K-kitチップを固定するために使用され、溝の底部には中央の開孔デザインがあり、上下の構造が重なると、TEM電子ビームが透過できるようになり、イメージ観測が実現します。

 

元々K-kitのサンプル準備は、塗料でTEM銅ネットに固定する必要がありました。この方法は、接着剤の硬化に時間がかかるだけでなく、塗料の過程で少しでも不注意があると、接着剤がK-kitの窓に流れ込み、シリコン窒化膜が汚染される可能性があります。この専用の銅ネットを導入することで、K-kitの使用の便利さとサンプル準備の速度が大幅に向上し、塗料の不適切な使用によるサンプル準備の失敗リスクを効果的に回避できます。また、この銅ネットは何度も再利用できるため、コスト削減にも大きな効果があります。

 

図10.K-kit 開閉式銅網の外観

 

 

3.3 湿式と乾式のサンプル準備

K-kitはモノリシック構造設計を採用しており、サンプル準備において顕著な差別化特性を示しています。図11に示すように、適切なサンプル準備方法を通じて、K-kitのマイクロチャネル内に乾式と湿式の2種類の異なるキャリブレーション状態を形成することができ、乾燥状態でも湿潤状態でも、均一で一貫したナノ粒子分布を維持し、安定した高品質の観測結果を確保します。

 

図11.湿式と乾式K-kitのTEM画像観察結果。本例K-kitにロードされたサンプルはNIST 100 nmポリスチレンです。

 

K-kitのサンプル準備プロセスでは、適切なマイクロチャネルのサイズを選択し、溶液のロードからコーティングシールまでの時間間隔を制御することで、表3に示す4種類の異なる液体貯蔵状態のサンプルを形成できます。一般的に、チャネルの高さが大きいK-kit（例えば2μm）を使用して乾式サンプルを準備することが推奨され、チャネルの高さが小さいK-kit（例えば0.2μm）は湿式サンプルの準備に適しています。その主な理由は、チャネルの高さが大きいK-kitは大きな開口端を持ち、液体が室温で自然に蒸発しやすく、真空環境下で迅速に除去できるためです。したがって、乾式サンプルを準備する際には、チャネルの両端に真空接着剤を塗布して密封する必要はなく、溶液が完全に乾燥することが保証されます。

 

表3.K-kit サンプル調製で実現可能な異なる貯蔵液体サンプル

 

ユーザーは分析のニーズに応じて、乾式または湿式のK-kitサンプルを選択できます。もし溶液内の粒子の形態、サイズ、または凝集状態を観察するだけであれば、より良いTEM画像品質を得るために、乾式K-kitを優先的に選択することをお勧めします。研究の目的が溶液内の化学反応（例えば、AuCl4–溶液が電子ビームの作用下で金を還元する反応）である場合や、K-kit内に溶液を保持する必要がある場合（例えば、生物や有機粒子の実際の形態を観察する場合）には、湿式K-kitを使用するのが適しています。さらに、いくつかのサンプル溶液はTEM電子ビーム照射下で気泡や乱れを引き起こしやすく、画像観察の明瞭さや安定性に影響を与える可能性があるため、乾式K-kit製造方法を使用して改善し、チャンネル内の溶液量を減らすことで電子ビームのサンプルへの影響を低減できます。乾式モードのK-kitサンプル製造では、チャンネル内を完全に乾燥させるか、壁面にナノ厚さの薄い液層を形成（3, 4）することができ、画像観察の質を効果的に向上させます。これもK-kitが市場の他の液体池チップ製品と比較して持つ主な利点の一つです。

 

3.4 ウェットネガティブ染色と多重ロード

独特なモノリシック構造に基づき、K-kitは市場で唯一、複数回のロード（multiple loadings）および湿式負染（wet negative staining）アプリケーションを実現できるマイクロ液池チップです。この利点は、低コントラストの生物試料の観察や免疫電子顕微鏡（immunoelectron microscopy）研究などにおいて、非常に大きな助けとなります。

 

K-kitは、触媒反応メカニズムの研究や免疫検査技術の開発など、異なる試料溶液を何度もロードする必要がある実験研究に応用できます（図12参照）。この独自の機能は、市場にある他のタイプの製品（例えば、2枚組み合わせ式液体池チップや原位液体TEMサンプルロッドなど）では実現できません。

 

図12.K-kitを使用すると、サンプルのロード操作を複数回実行でき、再ロードの回数に制限はありません。

 

図13はK-kitが免疫検査に応用された研究事例です。⁽⁵⁾本例では、分離処理を施した血小板α顆粒について、K-kit を用いて複数回の試料ローディングを繰り返し、金ナノ粒子標識されたα顆粒 (α Granules) の鮮明なTEM画像の取得に成功しました。この免疫学的試料の K-kit 調製プロセスは以下のとおりです。まず、K-kit にそれぞれ異なる溶液をローディングして内部洗浄と表面処理を行い、続いて一次抗体 Mouse monoclonal anti-P-selectin antibody と二次抗体 6-nm gold-conjugated goat anti-mouse IgG antibody を順にローディングし、37 °C に加熱した環境で約2時間培養して抗体反応を起こさせます。電子顕微鏡は蛍光信号を検出できないため、この免疫金標識法では金粒子を抗体と結合させ、電子顕微鏡画像における金の高いコントラストを利用して、血小板から放出されたすべてのα顆粒の位置を明確に標識します。

 

図13.K-kitを使用して複数回のロードステップを経て、6 nmナノゴールドで血小板放出物のα粒子のTEM画像結果を成功裏に標定した。(画像出典：⁽⁵⁾)

 

低コントラストの生物試料、例えばウイルス、細菌、リポソームやエクソソームなどの電子顕微鏡観察において、一般的に使用される画像改善方法は、いわゆる負染色処理です。負染色の原理は、重金属染料をナノ試料の周囲に堆積させることで、画像の背景を深くし、試料の形態を際立たせることです。従来の負染色の方法は、試料を置いた銅網に染料を滴下し、静置して乾燥させた後、銅網を電子顕微鏡に載せて観察します。しかし、この乾燥過程で、有機試料は水分が失われることにより構造が崩壊することがよくあります。特にリポソームやエクソソームなどの小胞型の生物試料は、元々球状であるべき試料粒子の外観が崩れ、染料が堆積することが容易です。MA-tekは豊富な生医療試料分析の経験を基に、独自のK-kit湿式負染色技術を開発しました。この技術により、「湿った」溶液状態でも試料の負染色効果を達成し、低コントラストの生物試料を液体環境で電子顕微鏡で鮮明に観察することが成功しました。

 

K-kitの湿式負染法は非常に簡単で、通常は2%酢酸ウラン（uranyl acetate, UA）溶液を負染剤として使用し、10μLの試料溶液と10μLの負染剤を均一に混合した後、直接K-kitに載せて観察することができます。ユーザーは、実際のテスト結果に応じて負染剤と試料溶液の混合比を適切に調整し、最適な負染効果を得ることをお勧めします。図14は人工コラーゲン繊維束（collagen fiber）が銅網とK-kit上での負染観察結果です。図14(b)に示すように、K-kitの湿式負染処理後、溶液状態でコラーゲン試料の束状構造の画像を明確に観察することができます。図15は2種類の非常に低い画像コントラストの生物試料、ミセルとエクソソームです。⁽⁵⁾その負染処理後のK-kitの画像観測結果。

 

 

 図14. コラーゲン繊維束の銅グリッドおよびK-kit上でのネガティブ染色画像結果

 

  図15.低コントラストの生物試料に対するK-kit湿式負染の観察結果

 

3.5 その他の製品特徴

K-kitは、さまざまなブランドのTEM装置での観測に適用できるだけでなく、市場で唯一、走査型電子顕微鏡と焦点イオンビーム－走査型電子顕微鏡（focus ion beam- scanning electron microscopy, FIB-SEM）での観測に同時に適用できる微型液体池チップ製品です。図16は、K-kitがTEMおよびFIB-SEMを利用して液体環境下で100 nm NISTポリスチレン粒子の画像比較結果を示しています。

 

図16. TEMとFIB-SEMを利用して100nmポリスチレン粒子のK-kit画像比較結果を観測した (本例で使用した観測装置はそれぞれHitachi HT7700 TEMとFEI Helios 400 FIBです)

 

さらに、K-kitの観測ウィンドウは、極薄（約30nm）の窒化ケイ素薄膜で構成されており、電子顕微鏡の電子ビーム透過画像を提供するだけでなく、ナノ粒子に対してエネルギー分散型X線分析（Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX）成分や格子回折などの分析を行うことができます。図17はFIB-SEM観測でK-kitにロードされた塩金酸（AuCl4）溶液が、電子ビーム還元反応後に形成された金粒子の画像と対応するEDX元素分析結果です。また、図18はK-kit内のナノ金粒子サンプルのTEM格子回折パターンの観察結果です。

 

図17.FEI Helios 400 FIB-SEMを使用してK-kit内の金粒子の画像とそのEDX分析結果を観察する (画像出典：⁽¹⁶⁾)

 

図18.K-kit内のナノ金粒子のTEM格子回折分析結果 (画像出典：⁽¹⁶⁾)

 

3.6 K-kitの応用例

K-kitは液体サンプルの電子顕微鏡観測において高い応用潜力を示し、多分野の分析ニーズをサポートします。例えば、電子産業では液体ナノ材料の開発やプロセス管理に応用でき、生医療分野では新薬の開発や病理メカニズムの研究に適しています。食品や飲料産業では、製品に新たに添加された成分や分布の分析に使用できます。さらに、K-kitは美妝製品にも応用でき、日焼け止めやナノ成分を含む化粧水などの検査に利用されます。^{(6, 13)}高効率で正確な包括的なナノ液体検査ソリューションを提供します。図19の応用例は、半導体プロセスで使用される化学機械研磨液（CMPスラリー）を直接K-kitにロードし、TEM画像観察および粒子サイズ分布の定量分析を行うものです。図20は、市販の日焼け止め製品に新たに追加された酸化チタン（TiO2）ナノ粒子の実際の例を分析したものです。

 

図19.K-kitによるCMP溶液のTEM画像分析結果

 

図20.市販の日焼け止め製品に新たにTiO2ナノ粒子を追加したK-kitの画像分析結果

 

特にナノ医療関連分野において、K-kitは卓越した応用価値を示しています。新薬開発、生物医学研究、疾病検査、血液スクリーニングなどに使用でき、具体的で直感的な液体サンプルの電子顕微鏡画像を提供し、医療診断と研究の発展を助けます。図21は、K-kitを使用してAbraxane®薬液中のタンパク質粒子のサイズ分布結果を分析した実際のケースです。

 

図21.K-kitを使用してAbraxane®薬液中のタンパク質粒子の画像分布を分析した様子

 

2008年には、研究チームがK-kitを利用して液相環境中の生細胞の電子顕微鏡観察を実現した。⁽⁷⁾。この研究では、K-kitを使用して生きた大腸菌（Escherichia coli）細胞を観察することに成功し、図22に示されているように、肺炎クレブシエラ（Klebsiella pneumoniae）が亜セレン酸塩還元を行う過程も観察されました。さらに、研究はK-kit内の肺炎クレブシエラと酵母（Saccharomyces cerevisiae）が連続TEM観察下でそれぞれ14秒と42秒まで生存できることを示しました。この実験研究は、液相TEMサンプルの準備プロセスを大幅に簡素化しただけでなく、最初の生細胞電子顕微鏡イメージング研究の成果を実現しました。この技術は解像度とフリーラジカル保護において依然として限界がありますが、その革新的な応用は現在でも液相生物イメージング分野の重要なマイルストーンと見なされています。⁽¹⁰⁾。

 

図22. K-kitを利用して生きた大腸菌細胞を成功裏に観察した (画像出典：⁽⁷⁾)

 

また、液体プールチップK-kitの応用により、生物の「体外(in vitro)」または「体内(in vivo)」で原液環境にある血液サンプルに含まれるナノ粒子の完全な物理化学特性分析を行うことができます。これは、人体における薬物の吸収、分布、代謝(metabolism)および排泄(excretion)などの薬物動態(pharmacokinetics)研究や物質毒性(toxicity)評価において、高い応用可能性を示しています。2012年に、学者はK-kitを用いてこのような関連実験研究を行いました。⁽⁸⁾その結果、クエン酸塩（citrate）やポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）などの異なるポリマーで修飾された金ナノ粒子を血液と混合し、それぞれK-kitにロードして金粒子の分散状態を観察します。同時に、この研究ではcPEG5kで修飾された金ナノ粒子をマウスに注射し、血液中の濃度の時間変化を追跡し、その結果を誘導結合プラズマ質量分析計（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）で測定されたデータと比較します。図23に示すように、K-kitの画像観察結果はICP-MSで測定された金粒子の濃度変化の傾向と高度に一致しており、K-kitが定性的および定量的分析の実用的な応用の可能性を持っていることを示しています。

 
図23. PEG修飾の金ナノ粒子をマウスの体内に注入し、K-kitとICP-MSを用いて血液中の金粒子濃度の時間変化の傾向を分析し、両者の分析結果を比較する(画像出典:⁽⁸⁾)

 

2022年に、学者はK-kitを利用して初めてグルタチオン（glutathione）分解酢酸菌（A. aceti）の動的発展過程を観測しました。⁽⁹⁾図24に示すように、この研究ではK-kitを使用して、グルタチオン分解酢酸菌の4つの主要な段階、すなわち付着と内部化、初期破壊、顕著な破壊、完全破壊の完全な変化画像を明確に観察しました。これは、微生物動態研究におけるK-kitの応用の可能性を示しています。

 

図24.K-kitを利用してグルタチオン修飾金ナノクラスター (GSH-AuNC) 処理後のA. aceti細菌完全破壊の過程を観察した (スケールバー：2μm)。本例の画像撮影時間はそれぞれ：GSH-AuNCsとA.acetiの共培養後 (a)80分、(b)86分、(c)96分、(d)114分。(画像出典：⁽⁹⁾)

 

2024年、研究チームはK-kit液池チップの応用を組み合わせることで、原位液相環境におけるナノ金粒子を含む小サイズのコロイド集合体に対する定量的な3D構造分析を実現する迅速な電子トモグラフィー技術を成功裏に開発した。⁽¹¹⁾コロイドアセンブリ体は、ナノまたはマイクロレベルのコロイド粒子が自己組織化、自己集積、または外力によって制御されて形成される秩序または非秩序構造体です。このような構造体は、高度な設計性と多機能性を持ち、薬物送達や生体材料、光電およびフォトニッククリスタル、触媒およびセンサー、機能性薄膜およびコーティングなどの重要な分野で広く応用されています。

 

電子断層スキャン技術は、ナノ材料の三次元構造研究に広く応用されており、特にコロイドナノ粒子の集合体分析に適しています。しかし、従来の電子顕微鏡観測は高真空条件下で行う必要があり、湿式コロイド化学法で調製された試料は、観測前に溶媒蒸発や固体基材への沈着などの前処理を経る必要があります。これらのステップは、ナノ粒子の元の配列構造を変えてしまうことがよくあります。この制限を克服するために、研究チームは図25に示すような革新的な技術を提案しました。この技術は、試料の液体原位環境を保持したまま電子断層スキャン観測を行うことができます。この方法は、市販のK-kit液体池チップを利用し、迅速な画像取得プロセスと専用の画像位置合わせおよび三次元再構成アルゴリズムを組み合わせることで、液相条件下での断層観測が直面する技術的課題を効果的に解決しました。この技術は、高効率かつ高解像度の構造解析能力を備えており、コロイドナノ粒子の集合体の原位観測と定量分析に新しい技術的アプローチを開きました。

 

図25.本例の研究ではK-kit液体プールチップを利用して迅速な電子断層スキャン技術を確立し、原液環境下で小型コロイドアセンブリの定量的三次元構造分析を行った。(a)実験研究に使用されたK-Kit液体プールチップの模式図；(b-c)単軸断層スキャンスタンドに搭載されたK-Kitチップの外観で、傾斜角はそれぞれ0°と45°；(d)液相迅速電子断層スキャンの傾斜系列収集方法：サンプルを継続的に傾斜させながら、サンプルの投影画像を同時に記録；(e)液体と真空中での迅速電子断層スキャン、および真空中での常温乾式電子断層スキャンに必要な時間と電子量の比較；(f-i)迅速電子断層スキャン傾斜系列の前処理プロセス；(g)自己監視学習の畳み込み自己エンコーダー (CAE) を使用したノイズ除去処理の模式図；(h)採用された再構築プロセスの概要；(i)最終処理後のスタック画像で、精製、整列、ノイズ除去が完了している。(画像出典：⁽¹¹⁾)

 

この他にも、最近の重要な応用研究には、K-kitを使用してTEM電子ビーム下で結晶を誘導成長させ、その三次元画像を再構築することが含まれます。⁽¹²⁾化粧品における活性ナノ粒子の分布と特性についての考察⁽¹³⁾、および抗がん剤ナノ結晶の研究観察および製造方法の開発⁽¹⁴⁾等。これらの研究テーマは内容が広範で多様であり、K-kitが生医応用分野における高い潜在能力を十分に示しています。

 

 

四、K-kitと原位液体TEMサンプルロッドの応用制限および技術比較

実際、K-kitは液体サンプルの電子顕微鏡観察において一定の適用制限があります。原位液体TEMサンプルロッド方案と比較して、K-kitの内部貯液チャンネルは閉じた空間であるため、静的な溶液観察にのみ適しており、流動液体の動的研究分析を実現することが難しいです。さらに、K-kitには回路、電極、またはセンサー素子が内蔵されていないため、微小領域加熱観察や電気化学反応などの関連研究を行うことも難しいです。

 

これに対し、その場液体TEMサンプルホルダーはより強力な機能を備えており、流動する液体を導入して液相環境下での動的観察、例えばナノ粒子の成長、電気化学反応、生体分子の運動などを行うことができます。また、その組み合わせ式液体セルチップには電極設計が施されていることも多く、液体環境中で電場を印加して電池電極材料の充放電プロセスや電気触媒反応メカニズムを研究でき、さらに電極を通じて局所的な加熱を行い、温度変化が材料の溶解、結晶化、相変化などに与える影響を検討できます。したがって、その場液体TEMサンプルホルダーは、より深い学術研究への応用に特に適しています。

 

しかし、迅速な分析結果が求められる産業用途や、多数のテストサンプルを処理する研究シーンでは、原位液体TEMサンプルロッドだけではニーズを完全に満たすことは難しい。そのため、ユーザーは分析目的に応じて最適な技術を選択することをお勧めします。また、K-kitと原位液体TEMサンプルロッドの製品技術の利点を組み合わせて使用することで、効率と包括性を兼ね備えた液体ナノ材料の検査ソリューションを構築することができます。表4では、K-kitと原位液体TEMサンプルロッドの技術的特徴を比較し、ユーザーの参考に供しています。

 

表4.K-kitと原位液体TEMサンプルロッドの技術的特徴の比較

 

五、結論

K-kitの応用により、高品質な液体サンプルの電子顕微鏡画像観測が可能となります。液体サンプルの最終製品における実際の状態や一般的な乾燥サンプルに対して、ナノ物体やその集合体の現象を直接観察・分析することができます。K-kitは、使いやすさ、迅速な検出、高い適用性などの利点を持ち、分析のニーズに応じて、さまざまな異なる液体サンプルを準備することができ、湿式負染色、複数回のロード、格子回折、成分分析などの独自の機能を実現します。これは、複雑なテスト条件を持つ学術研究と産業関連のナノ溶液分析の両方に同時に適用できる市場で唯一の最適な選択肢です。

 

 

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著者紹介

 

陳弘仁先生は国立成功大学航空宇宙工学研究所の博士であり、現在はMA-tek株式会社の研究開発センター所長です。

Hung-Jen Chenは国立成功大学の航空宇宙研究所で博士号を取得しました。現在、彼はMA-tek Inc.の研究開発センターの所長を務めています。